لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (PDF) مراجعه فرمایید.

ویروس زردی نکروتیک رگبرگ چغندر قند (Beet necrotic yellow vein virus) عامل بیماری مهم ریشه گنایی یا ریزومانیا (Rhizomania) در چغندرقند است. در تحقیق حاضر طی سال 1384 در شیراز، به منظور استفاده از روش های سرولوژیکی (ازجمله آزمون الیزا) در تشخیص بیماری و نیز استفاده از این روش ها در برنامه های اصلاحی چغندرقند جهت انتخاب ژرم پلاسم متحمل به بیماری، جدایه ایرانی ویروس مذکور خالص سازی و آنتی بادی علیه آن تولید شد. بدین منظور ابتدا بافت موردنیاز برای خالص سازی با مایه زنی عصاره برگ چغندرقند آلوده به ویروس مذکور، روی برگ های Willd Chenopodium quinoa تهیه شد. خالص سازی ویروس از بوته های آلوده C. quinoa شامل عصاره گیری بافت آلوده در بافر فسفات، تصفیه مقدماتی، سانتریفوژ کردن از میان بالشک سوکروز 20 درصد و سانتریفوژ کردن در ستون سوکروز دارای شیب چگالی بود. در نهایت، باند ویروسی در لوله سانتریفوژ به صورت پراکنده که عمدتا در سه ناحیه دارای فشردگی بیشتری بود، تشکیل شد. برای تهیه آنتی سرم، ویروس خالص شده به طور زیر جلدی به خرگوش سفید نیوزلندی تزریق شد. آنتی سرم حاصل پس از جذب با عصاره گیاه سالم و جداسازی گاماگلوبولین و تهیه آنتی بادی متصل به آنزیم، برای آزمون الیزا قابل استفاده بود. آنتی سرم تهیه شده دارای کیفیت بالایی بود و با عصاره گیاه سالم واکنشی نشان نداد. آنتی سرم مذکور برای انجام تحقیقات موردنظر در موسسات آموزشی و پژوهشی قابل استفاده است.

به منظور بررسی گسترش آلودگی ویروس رگبرگ زردی نکروتیک چغندرقند و ناقل آنPolymyxa betae Keskin  در منطقه مرودشت در استان فارس، تعداد 353 نمونه تصادفی و 124 نمونه از گیاهان دارای علایم رایزومانیا در تابستان سال 1383 جمع آوری گردید. به وسیله آزمون های سرولوژیکی ساندویچ سه طرفه الیزا و با استفاده  از پادتن تک سویه ویروس، وجود ویروس به ترتیب در 48.2 درصد و 81 درصد از نمونه های تصادفی و علایم دار ردیابی و مشاهده شد. عصاره ریشه های موئین نمونه های آلوده به صورت مکانیکی روی گیاهان محک مایه زنی شد و به ترتیب درChenopodium quinoa  منجر به لکه های کلـروتیـک و نهـایتا نکروتیک شد و در C. amaranticolor تولید لکه های نکروتیک موضعی کرد. آزمون زنجیره ای پلی مراز نیز در مورد گیاهان آلوده توسط آغازگرهای اختصاصی RNA1 تا RNA4  انجام شد و به صورت ملکولی وجود ویروس را تایید کرد. با استفاده از آغازگرهای اختصاصیP. betae  وجود قارچ ناقل در 94 درصد از نمونه های جمع آوری شده ثابت گردید. در نهایت بخشی از RNA4 این ویروس نیز تعیین توالی شد و با سایر توالی های ثبت شده در بانک ژن مقایسه گردید که به ترتیب 99.3 و 99.6 درصد با جدایه های گزارش شده از ژاپن و ایتالیا مشابهت داشت.

تاکنون ویروس های رگبرگ زرد نکروتیک چغندرقند (Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV) و سوختگی سیاه چغندرقند (Beet black scorch virus, BBSV) به طور مجزا در ریشه های آلوده از مزارع چغندرقند ایران ردیابی شده اند. هدف از این مطالعه ردیابی هم­زمان دو ویروس ذکرشده به منظور صرفه جویی در زمان و انرژی در فرآیند تشخیص آلودگی بود. بدین منظور از سه روش استفاده شد. در روش اول (روش رایج): ویروس ها با استفاده از واکنش زنجیره ای پلی مراز با ترانویسی معکوس (RT-PCR) به وسیله آغازگرهای اختصاصی مربوط به هر کدام و مجزا از یکدیگر روی ریشه آلوده ردیابی شدند. در روش های دوم و سوم، این دو ویروس به ترتیب با استفاده از واکنش زنجیره ای پلی مراز با ترانویسی معکوس به صورت تکی (Simplexrt-PCR) اما هم زمان در یک ترموسایکلر و به صورت دوگانه (DuplexRT-PCR) با به­ کارگیری دو جفت آغازگر اختصاصی ردیابی شدند. نتایج در روش های دوم و سوم نشان داد که با بهینه سازی دمای اتصال آغازگرهای اختصاصی (56 درجه سانتی گراد) مبتنی بر ناحیه ژن کد کننده پروتئین پوششی، به ترتیب قطعات هدف 391 و 453 جفت بازی از ژنوم BNYVV و BBSV تکثیر می یابند. در نتیجه این دو روش جهت ردیابی هم زمان مناسب بوده و ازنظر صرفه جویی در زمان و انرژی مقرون به صرفه است و همچنین قابلیت استفاده از آن ها به منظور تهیه نقشه پراکنش در مناطق کشت چغندرقند و نیز ارزیابی و شناسایی لاین­ های مقاوم چغندرقند در برنامه های به نژادی در شرایط گلخانه وجود دارد.

بیماری رایزومانیا یکی از بیماری های مهم و مخرب چغندرقند در سراسر دنیا می باشد که در سالهای اخیر خسارات هنگفتی را به محصول چغندرقند در کشور ما وارد کرده است. این ویروس به وسیله قارچ خاکزادPolymyxa betae  منتقل می شود و دارای سه تیپA ،B  و P می باشد. تیپ B از لحاظ گسترش جهانی در مقام دوم پس از تیپ A قرار دارد. در این بررسی جهت شناسایی تیپ B از روش RT-PCR استفاده گردید. ابتدا نمونه های مشکوک به بیماری از مزارع مختلف استانهای خراسان رضوی و شمالی جمع آوری شد و آلودگی آنها با آزمون DAS-ELISA مشخص گردید. آزمون RT-PCR برای تشخیص تیپ B با ایجاد تغییراتی شبیه روش بکار رفته در تیپ A بود. در این روش، پس از استخراجRNA  کل گیاه با استفاده از روش رسوب باPEG6000 ، cDNA ویروس با استفاده از آغازگر اختصاصی معکوس (مربوط به ناحیه TGB از RNA2 ژنوم ویروس)، ساخته شد و به دنبال آن با استفاده ازcDNA  تکثیر شده و آغازگرهای اختصاصی واکنش PCR صورت گرفت. الکتروفورز محصول PCR در ژل آگارز 5/1 درصد و پلی اکریل آمید 5 درصد نشان داد که در سه نمونه از 20 نمونه مورد آزمایش، قطعه تکثیر شده مربوط به تیپ  B در محدوده 178bp وجود دارد. این اولین گزارش از وجود تیپ B با استفاده از آغازگرهای اختصاصی در آزمون RT-PCR می باشد.

ویروس رگبرگ زرد نکروتیک چغندر (BNYVV) عامل بیماری ریزومانیا می باشد که یکی از بیماری های مهم چغندرقند به شمار می آید. BNYVV عضو تیپ جنس بنی ویروس بوده و دارای چهار تیپ A، B، P و J است که از نظر جغرافیایی به مناطق خاصی محدودند. از نظر بیماری زایی، بین تیپ های A وB تفاوتی وجود ندارد ولی تیپ های P و J دارای یک مولکول RNA5 بوده و بسیار مهاجم تر می باشند. هیچ یک از این تیپ ها را نمی توان به طریق سرولوژیکی از هم تشخیص داد. به منظور شناسایی تیپ های ویروس عامل بیماری ریزومانیا در منطقه چناران، 28 نمونه ریشه چغندرقند دارای علایم ریشه ریشی مشکوک به ریزومانیا، از حوزه کارخانه قند چناران در تابستان 1385 جمع آوری گردید. ابتدا ویروس عامل بیماری (BNYVV) توسط آزمون الایزا به روش ساندویچ دو طرفه و واکنش RT-PCR در نمونه ها ردیابی شد. در نمونه های آلوده، با استفاده از آغازگرهای اختصاصی تیپ های ویروس BNYVV و واکنش RT-PCR، تیپ ویروس تعیین گردید. از 28 نمونه دارای علایم مشکوک به ریزومانیا، آزمون الایزا در 23 نمونه و واکنش RT-PCR در 25 نمونه، ویروس BNYVV را ردیابی کرد. واکنش RT-PCR توسط آغازگرهای اختصاصی تیپ، فقط قطعه ای به اندازه 324 جفت باز را تکثیر نمود. به این ترتیب در کلیه نمونه های آلوده، ویروس عامل بیماری، تیپ A تشخیص داده شد.

در تابستان 1399 نمونه هایی از بابونه طبی (Matricaria chamomilla L. ) در چند مزرعه گیاهان دارویی در هرسین استان کرمانشاه با علایم کاهش رشد در اراضی که در سنوات قبل تحت کشت چغندرقند با سابقه آلودگی به ویروس Beet necrotic yellow vein virus-BNYVV بودند، مشاهده و جمع آوری شد. نمونه ها از نظر آلودگی به BNYVV با استفاده از روش الایزا (Clark and Adams, 977) و متعاقبا روش RT-PCR بررسی شدند. در آزمون الایزا از 9 نمونه، تعداد 7 نمونه دارای واکنش مثبت بود که سه نمونه انتخاب و با استفاده از آزمون RT-PCR و آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر بخشی از ژن پروتیین پوششی BNYVV بررسی شد. نتایج نشان دهنده تکثیر یک قطعه DNA به طول مورد انتظار 570 جفت باز در هر سه نمونه بود. توالی نوکلیوتیدی در مورد یکی از نمونه ها (Cham7) تعیین (MZ368701) و با استفاده از ابزار BLAST موجود در پایگاه NCBI با توالی های موجود در GenBank مقایسه شد. توالی نوکلیوتیدی به دست آمده در این تحقیق بیشترین درصد یکنواختی (6/99< درصد) را با توالی های گزارش شده از BNYVV داشت. مقداری خاک از مزرعه ای که نمونه های اولیه از آن ها جمع آوری شده بود، تهیه گردیده و بذور بابونه پس از ضدعفونی سطحی در آن کشت شد. نتایج آزمون RT-PCR روی این گیاهان، تایید کننده آلودگی آن ها به BNYVV بود. وقوع نسبتا گسترده BNYVV در مزارع چغندرقند کشور قبلا گزارش شده است (Farzadfar, 2009). ویروس BNYVV از گیاه بابونه آلمانی (Chamomilla recutita) از کشور ترکیه گزارش شده است (Kutluk et al, 2000)، ولی این اولین گزارش از وقوع آلودگی طبیعی BNYVV در گیاه بابونه طبی در ایران می باشد.

قارچ پلی میکسا بتا (Polymyxa betae) از پارازیتهای اجباری و انتشار جهانی دارد. این قارچ خاکزاد و پارازیت داخلی ریشه برخی گیاهان مانند اعضا خانواده های خرفه (Portulaceae)، سلمه (Chenopodiaceae)، تاج خروسیان (Amaranthaceae)  و ناقل تعدادی از ویروسهای بیماریزای گیاهی از جمله ویروس زردی نکروتیک رگبرگ چغندرقند(BNYVV)  می باشد. این ویروس از لحاظ اقتصادی از مهمترین ویروسهای آلوده کننده چغندرقند است. اسپورهای این قارچ قادرند سالها در خاک خشک باقی بمانند. با توجه به اهمیت این ویروس، در تابستان 1384 اقدام به جمع آوری خاک و نمونه های مشکوک به آلودگی از مزارع چغندرکاری استان گردید و تعداد 48 نمونه از مزارع تربت حیدریه، چناران، نیشابور، فریمان و بجنورد جمع آوری شد. به منظور تشخیص ویروس BNYVV از آزمون داس الایزا (DAS-ELISA) استفاده گردید. از آزمون طعمه گذاری در خاک جهت جداسازی قارچ موردنظر از خاک استفاده شد. شش هفته بعد ریشه ها از خاک خارج و پس از شستشو با آب در هیدروکسید پتاسیم 10 درصد قرار داده شد. سپس قطعاتی از آنها جهت مشاهده فرم پایدار قارچ با میکروسکوپ نوری بررسی شدند. استفاده از میکروسکوپ نوری جهت تعیین پلی میکسا بتا به علت اشکال در رویت فرمهای نابالغ و کوچک و عدم تمایز بین زئوسپورانژیومها و اسپورهای مقاوم سایر قارچها غیر قابل اطمینان و زمان بر است. بنابراین استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلیمراز به عنوان روشی سریع و دقیق مورد استفاده قرار گرفت. برای استخراج آر. ان. ا از غده های نمونه های آلوده از روش رسوب با PEG6000 استفاده شد و بدنبال آن نسخه برداری به طریق وارونه (RT-PCR) جهت ساخت cDNA با استفاده از آغازگر اختصاصی ژنوم قارچ انجام پذیرفت. آزمون پی. سی. آر با استفاده از آغازگرهای اختصاصی رفت و برگشت ژنوم این قارچ بر اساس داده های مونیه و همکاران صورت گرفت. الکتروفورز محصول پی. سی. آر در ژل پلی اکریل آمید 5 درصد و نیز آگارز 1.5 درصد تکثیر قطعه ای به اندازه 170 جفت باز را تایید نمود که نشانگر آلودگی نمونه ها به قارچ پلی میکسا بتا بود. با بکارگیری این روش ردیابی قارچ پلی میکسا بتا به طور مستقیم از آر. ان. ا استخراجی امکان پذیر می باشد.

ویروس رگبرگ زرد نکروتیک چغندرقند (Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV) در چغندرقند بیماری مهم و خطرناکی بنام ریشه ریشی (root beardiness) یا ریشه گنائی (rhizomania) ایجاد می کند و دارای گسترش زیادی در اکثر نقاط دنیا است. این ویروس دارای چند قطعه آر ان ای ژنومی می باشد و آران ای شماره 3 آن یک پروتئین 25 کیلودالتونی که مسوول بیماری زایی در گیاه چغندرقند است را رمز گذاری می کند. موقعیت های آمینواسیدی 67 و 68 این پروتئین نقش مهمی در شکستن مقاومت ارقام مقاوم دارند. در این مطالعه p25 در سه جمعیت BNYVV از مغان، لرستان و فارس در ارقام حساس و مقاوم چغندرقند مورد بررسی قرار گرفت. دو جمعیت لرستان و فارس در چهار گذرش پیاپی به ارقام مقاوم و حساس مایه زنی شدند و ژن p25 ویروس در آنها بررسی شد. بر اساس نتایج حاصله انتقال پیاپی ویروس در گیاهان مقاوم منجر به تغییراتی در موقعیت های آمینواسیدی 30، 49، 67، 68، 129، 163 و 198 در p25 شد، در حالی که در گیاهان حساس تغییرات آمینواسیدی دیده نشد. بیشتر تغییرات تتراد (آمینواسیدهای 70-67) در موقعیت آمینواسیدی 67 مشاهده گردید. وجود بیوتیپ P در مغان و لرستان تشخیص داده شد. از آنجا که انتخاب تحت فشار ارقام مقاوم می تواند نقش مهمی در ظهور بیوتیپ P ایفا کند، بنابراین حضور بیوتیپ P در دو منطقه در ایران ممکن است به علت کشت ارقام مقاوم بوده باشد. برخی پارامترهای تکاملی و موتیف های p25 مورد بحث قرار گرفته است.